灵芝的作用

提要  灵芝的热水提取物250或500mg/kg口服可以明显降低因D-氨基半乳糖和内毒素合用导致中毒的小鼠血清谷丙转氨酶的活力升高。灵芝在试管内能减少大鼠原代培养肝细胞受四氨化碳中毒时释放的乳酸脱氢酶及谷丙转氨酶。灵芝也降低口服四氯化碳导致肝中毒的小鼠血清谷丙转氨酶活力。由此证明灵芝对于受损的动物肝脏有一定的保护作用。 
关键词  灵芝；动物肝损伤；谷丙转氨酶 
灵芝是高等真菌Ganoderma Lucidum, Fr. Karst的子实体，在中国传统用作补药及镇静药。根据《本草纲目》记载，灵芝能补五脏之气。本文研究灵芝的热水提取物对肝脏损伤动物病理模型的作用。 
1967年发现D-氨基半乳糖可引起大鼠肝脏受损并称其病理变化与人类肝炎病变有一定相似性。但动物对D-氨基半乳糖的敏感性存在较大的种属与个体差异，小鼠远不及大鼠敏感。有报道内毒素可以增加D-氨基半乳糖的毒性[1]。本实验着重研究D-氨基半乳糖及内毒素对小鼠肝脏的损害作用，并观察灵芝对此损害的影响。此外，四氯化碳是一种经典的肝毒剂，本研究分离大鼠肝细胞观察四氯化碳对原代培养肝细胞的损害，并整体引致小鼠中毒，观察灵芝对该中毒的影响。 
材料与方法 
动物 
昆明种小鼠，21～26g;Sprague Danley(SD)种大鼠，180～220g。♂♀兼用。均由上海医科大学实验动物部供应。 
试剂 
灵芝热水提取物由日本和汉生药研究所提供，为棕黄色粉末。取一定量灵芝提取物溶于0.2%羧甲基纤维素钠（CMC），作整体动物研究。灵芝溶于生理盐水中于80℃水浴振荡2h后离心为水溶性部分（Part A）。在振荡后经三次快速冻融，然后离心，上清称为冻融部分（Part B），作试管内研究用。 
D-氨基半乳糖（D-Galactosamine, Galn）由重庆医科大学制备。内毒素（Endotoxin,ET）O55B5由第二军医大学制备。I型胶原蛋白酶为Sigma产品。RPMI-1640培养基为GIBCO产品，含Hepes 15mM，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml及小牛血清10%。 
D-氨基半乳糖与内毒素所致小鼠中毒模型 
小鼠随机分为4组：第一组对照；第二组腹腔注射D-Galn 500mg/kg 30min 后再腹腔注射ET 100μg/鼠；第三组单独腹腔注射ET；第四组单独腹腔注射D-Galn。给毒剂后10h，分别取血，分离血清，测定血清谷丙转氨酶（GPT）及谷草转氨酶（GOT）活力。 
灵芝对联合中毒小鼠肝脏的保护作用 
小鼠随机分成三组：第一组腹腔注射D-Galn 500mg/kg及ET100μg/鼠作对照；第二、三组分别口服灵芝250或500mg/kg qd.×2。最后一次服用灵芝后1h，腹腔注射D-Galn及ET。给毒剂后10h，小鼠摘眼球取血、分离血清，测GPT及GOT。 
血清中IL-1活性测定 
上述各组小鼠血清以BALB/c小鼠的胸腺细胞生物检测其IL-1含量。选用BALB/c小鼠，分离胸腺，进而分离胸腺细胞，尼龙网过滤，离心，洗2次，计数，调至1×107/ml含Con A 2.5μg/m。取96孔培养板，每孔加入胸腺细胞0.1ml及稀释血清0.1ml，37℃ 5% CO2中培养72h。终止培养前6h，每孔加入3H-TdR 9.25kBq。培养结束后将细胞收集于纤维薄膜，β-液闪仪测cpm值。 
大鼠离体肝细胞的制备及灵芝对CCl4中毒的保护作用 
按Berry和Friend法分离大鼠肝细胞：大鼠于乙醚麻醉下门静脉插管，恒压灌流，流量9ml/min。开始时先灌流无Ca2+的生理溶液 A（96mM NaCl, 1.4mM KCl, 0.74mM MgSO4, 2.5mM KH2PO4,30mM NaHCO3及21.7mM葡萄糖酸钠），持续通入95% O2/5% CO2的混合气体，pH7.4, 恒温37℃。洗净肝脏内血液后，灌B液，含0.02%胶原蛋白酶，持续灌流8min。然后灌C液，含Ca2+及牛血清白蛋白1%，持续灌流4min。分离肝脏，置烧杯中，溶液含Ca2+及牛血清白蛋白，剪破肝脏包膜，释出肝细胞，于水浴中振荡数分钟，尼龙网过滤细胞，离心500rpm 1min。再洗2次。细胞于RPMI-1640溶液中计数，台盼蓝测活力应达90～92%，调节细胞浓度至5×106/ml。于24孔板中，每孔加入1ml。每组复管3孔。加入不同浓度灵芝（最终达0.01～10mg/ml）及20μl CCl4， 5% CO2 37℃培育1h，离心3000rpm,10min,分离上清，测定肝脏释放的乳酸脱氢酶（LDH）及GPT，以加入1% Triton X-100后肝脏细胞释放的酶活力为酶活力之总值[3]。 
整体小鼠CCl4中毒及灵芝的保护 
小鼠随机分成4组：A组对照，B组腹腔注射0.01% CCl4 0.18ml/10g, C及D组分别口服灵芝250或500mg/kg qd.×2。在第二次服药后1h腹腔注射上述量CCl4,24h后取血，分离血清，定量稀释，测GPT和GOT。 
结    果 
一、D-Galn合并ET致小鼠肝脏中毒 
D-Galn 500mg/kg单独应用，只使小鼠SGPT轻度上升。ET 100μg/鼠并不引起明显的肝脏损害。当D-Galn与ET合用时，SGPT明显上升，P<0.01（表10-1）。 
    表10-1  D-氨基半乳糖和内毒素致毒小鼠的血清酶活性 
              Galn                ET           鼠数             GPT            GOT 
  组别       (mg/kg)        (μg/只)                   （U/ml±SD）    (U/ml±SD) 
   A           --                --                   5           92±53             67±25 
   B           500            100                 5           454±209**      106±16* 
   C           500             --                  5           157±88*           74±26* 
   D           --                100               4           59±17**          48±13* 
   B与A比较，C、D与B比较：*P<0.05,  **P<0.01 
二、灵芝对联合中毒小鼠肝脏的保护作用 
表10-2表明给予口服灵芝250及500mg/kg均明显降低肝脏中毒小鼠的GPT活力，GOT亦有降低趋势。 
      表10-2  灵芝对联合致毒小鼠肝脏的保护作用 
   组 别       mg/kg         Galn/ET         鼠数             GPT          GOT 
                                                               （U/ml±SD）    (U/ml±SD) 
   灵芝         --                  +                  6                 1474±548       238±101 
   灵芝         250               +                  6                  583±733*       127±44* 
   灵芝         500               +                   6                 310±182**      162±161 
Galn: 500mg/kg; ET: 100μg/鼠； *P<0.05,  **P<0.01 
取出上述各组小鼠的血清研究灵芝对中毒小鼠血清中IL-1样物质活力的影响。发现小鼠于联合中毒后血清IL-1样物质水平明显低于对照组。灵芝可使降低的IL-1趋于升高，提示联合中毒小鼠免疫功能低下，灵芝对具有免疫调节作用的单核细胞因子的IL-1有一定的调节作用（表10-3）。 
     表10-3  灵芝对联合中毒小鼠IL-1样物质的影响 
                                              血清稀释                  
                             鼠数              1∶40              1∶20            1∶10 
对照                   5        16319±6261        5828±1241        627±158 
Galn/ET             4        7240±4843        2876±2439        480±393 
灵芝Galn/ET      5       11351±7384         3085±1746        308±88 
三、灵芝对CCl4致离体大鼠肝细胞中毒的保护作用 
表10-4结果表明，灵芝对CCl4中毒的原代培养肝细胞有一定保护作用。加入灵芝以后，肝细胞释放的LDH及GPT均明显降低。 
      表10-4  灵芝对CCl4中毒毒肝细胞的作用  
                CCl4     灵芝              LDH                     GPT 
               μl/孔    mg/ml      X±SD     释放率（%）     X±SD    释放率（%） 
                  --      --           6800±200        39.4          43±3           23.6 
CCl4          20      --          14483±525       84.0         145±5         79.7 
Part A       20      0.01       10225±225     59.3           85±6          46.7 
                 20      0.1         9667±289      56.0            86±6        47.5 
                 20      1           9417±144      54.6             85±2        46.9 
                20      10          9983±475      57.9             51±5         28.0 
Part B    20      0.01          7717±375       44.7            62±3        34.1 
             20      0.1            9667±289      56.0             88±4       48.1 
              20      1             8700±260      50.4             73±6        40.3 
             20      10           10900±450      63.2           48±3        26.4 
  
四、灵芝对整体CCl4中毒小鼠的作用 
表10-5结果表明灵芝能明显降低CCl4中毒小鼠的血清GPT活力。 
          表10-5  灵芝对CCl4致毒肝脏的保护作用 
  组别        mg/kg        CCl4        n         GPT             GOT 
                            (ml/10g)               (U/ml±SD)      (U/ml±SD) 
  对照         --         --                9         52±7           164±96 
  CCl4         --         0.18          9         1015±0          426±756 
  灵芝         250        0.18       10         883±235        2192±1366 
  灵芝         500        0.18       10       712±396        1660±930 
讨      论 
早在1000多年前，中国古代医药学者已经注意到灵芝对肝脏的作用，故有灵芝“补肝气”之说。当然在《本草》中所指的“肝脏”具有更广泛的含义，其所指灵芝具有补肝气作用的确切含义亦待研究。 
本研究重点是灵芝对肝脏受损病理模型的影响。 
GPT和GOT均为反映肝细胞变性坏死的酶类，当肝细胞因中毒等发生变性坏死时酶类会释放出来，使血清中该类酶水平升高。由于GOT尚分布于心脏、肾脏与骨骼肌，而GPT则主要分布于肝脏，故血清GPT水平反映肝脏受损较GOT更特异，更敏感，在临床急性肝炎时持续升高时间也最长。灵芝能明显降低两种整体病理模型及中毒离体肝细胞释放的GPT，表明灵芝有一定的护肝作用。 
乳酸脱氢酶广泛分布于体内各组织，催化乳酸转变为丙酮酸。肝炎的发病早期血清中该酶升高，亦反映肝细胞的受损。本文原代培养的大鼠肝细胞在CCl4中毒时LDH释放显著升高，灵芝能使之降低，亦提示灵芝的护肝作用。 
IL-1是一种重要的单核细胞因子，有广泛的生物学活性，参与主要的免疫反应过程，其重要作用之一是刺激T细胞产生IL-2，既能调节免疫应答的水平，又有效应作用。在肝脏中毒时有关血清IL-1的水平未见报道，本研究用D-Galn和内毒素造成肝脏中毒，结果发现这种联合中毒致肝损伤的小鼠，血清中IL-1水平较正常动物的水平为低，提示肝脏中毒时机体的免疫功能下降。服用灵芝后IL-1水平有上升趋势，这与本室其他研究结果相符，说明灵芝具有一定的免疫调节作用。
灵芝的保健作用表现在如下方面： 

(一)提高超氧歧化酶作用 
灵芝有提高超氧歧化酶作用，能消除体内自由基，降低体内丙二醛(MDA)的含量，提高细胞膜的流动性和封闭度，保护细胞膜、细胞器、核酸、酶等生物活性物质不受自由基破坏。提高超氧歧化酶的作用主要表现在： 

1． 提高细胞超氧歧化酶(SOD)的活性 灵芝能提高机体超氧歧化酶作用，其作用大小与灵芝使用量有关。李瑞、韩群等用大鼠试验，当口服灵芝量为62.5mg/kg时，其SOD活性比对照提高14％，当口服灵芝量为500mg/kg时，其SOD活性比对提高32．7％。 

2． 抑制超氧阴离子自由基的产生。 

3． 抑制脂质过氧化 脂质过氧化可导致细胞膜结构的破坏，使细胞膜的生理活性降低或丧失，细胞膜主动吸收能力下降。脂质过氧化的产物--脂褐质素会积累于血管内壁和表皮，造成血液循环障碍和产生老年斑等，降低体内脂质过氧化水平，对提高机体健康、延缓衰老，提高神经系统的功能，有重大的意义。 

(二)抗血栓形成及提高红细胞变形能力 

灵芝能提高红细胞的变形能力和降低血小板的聚集性能。 

(三)灵芝提高细胞合成DNA、RNA、蛋白质的能力 

灵芝能提高DNA多聚酶活性，提高肝、骨髓、红细胞合成DNA、RNA、蛋白质的能力。 

(四)提高机体免疫力 

灵芝对提高机体免疫功能有着十分良好的效果。灵芝能促进淋巴细胞增殖，提高巨噬细胞、NK细胞、T细胞的吞噬能力和杀伤力，能显著抑制卵蛋白和破伤风类毒素对脉鼠的致敏作用，促进正常小鼠抗羊红细胞(SRBC)、空斑形成细胞(PFC)反应。体外试验灵芝能促进刀豆蛋白A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应，同种异型抗原刺激的淋巴细胞的转化作用。 

(五)灵芝护肝解毒作用 

灵芝对保护肝脏免受化学物质和病毒的损害有良好的效果。灵芝对肝炎病毒引起的肝炎的防治主要靠提高机体免疫功能来实现；灵芝对有毒化学物质的对抗主要靠提高肝脏解毒能力来实现。 

(六)灵芝可提高机体耐缺氧能力、提高血液供氧能力、提高动筋脉氧差和降低机体静止状态下的耗氧量。 

(七)降低血液粘度，增加心肌收缩力，增加冠状动脉血流量和心血输出量，改善心律。 

(八)抗肿瘤 灵芝能防止肿瘤发生和抑制肿瘤生长。对动物移植瘤的抑制效果较好，但对原发瘤的抑制效果比较差。 

(九)抗放射性射线和有毒化学物质对机体的损害 

试验结果表明，灵芝提取物能对抗放射性射线和有毒化学物质(如四氯化碳、环磷酰胺、二硫化碳、苯等)对机体的损害。小鼠先注射环磷酰胺，20h后注射灵芝提取液，再解剖测定各项生理指标。结果表明，小鼠的肝脏、骨髓、血清合成DNA、RNA、蛋白质的能力和正常小鼠接近；白血球、血小板、红血球的量也和正常小鼠相近。小鼠先口服灵芝提取液，再用致死剂量Co60照射，1周后对照组全部死亡，灵芝组死亡率为20％，灵芝防止骨髓细胞微核千分率的升高，其效果与辐射防护剂--L-半胱胺酸相仿。 

(十)镇静、镇痛作用 

灵芝有明显的镇痛、镇静效果，腹腔注射灵芝酊水溶液(每毫升相当于生药1g) 20g／kg，能显著减少小鼠自发性活动次数，延长睡眠时间；能显著增强戊巴比妥钠的作用，并延长其作用时间，降低其半数有效量，其最小量由原来35mg/kg，降低至25.36mg/kg 

(十一)灵芝的其它药用作用 

灵芝除上述药理作用外，有报道灵芝还具有提高机体生命力和抗逆能力的效果，能平喘、止咳、祛痰及治疗慢性气管炎，并具有降血糖、降血脂、降血压的作用，这里不再一一赘述。 

(十二)灵芝的毒性 

经动物急性和亚急性毒性试验表明，目前已开发和应用的数种灵芝毒性极低，口服引起的死亡都是由于超量服用饱胀而造成，灵芝无副作用。