苦参注射液生物碱类成分指纹图谱的研究
苦参为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait的干燥根。2005中国药典以苦参碱和氧化苦参碱为对照，采用高效液相色谱法测定其含量。文献报道的苦参碱和氧化苦参碱的含量测定方法较多，主要为高效液相色谱法和薄层扫描法，另外还有GC、毛细管电泳法、离子交换法等。
一、 高效液相色谱法中药网www.zhong-yao.net
⑴2005版中国药典苦参含量测定项下：
色谱条件：以氨基键合硅胶为填充剂；以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（80：10:10）为流动相；检测波长为220nm。理论板数按氧化苦参碱峰计算应不得低于2000。
供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液0.5ml，精密加入三氯甲烷20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，通过中性氧化铝柱（100～200目，5g，内径1cm），依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇（7：3）各20ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇适量使溶解，并转移至10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
⑵文献报道的HPLC法
苦参药材的含量测定：
张杰等用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定苦参药材的含量：采用岛津LC10ATvp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Lambdal6紫外分光光度仪(美国PE公司)；十八烷基硅烷键合硅胶柱(250mm×4.6mm，5μm)；乙腈-水(加0.04％三乙胺，以磷酸调pH7.0)(20：80)为流动相；流速：1.0mL/min；室温；紫外检测波长为215nm。样品溶液的制备参照2000版《中国药典》苦参含量测定项下的方法。通过对TLCS法和RP-HPLC法进行方法学比较研究，表明该两种方法测定苦参药材中苦参碱含量差异无显著性。RP-HPLC法供试样品直接进样，在封闭的环境下，进行分离、测定，外界因素对含量测定结果影响小，且进样、分离、测定仪器可连续进行，简便、快速，RP-HPLC法重现性好。
张毅应用高效液相色谱(HPLC)法对苦参中苦参碱的含量进行测定：LC-10Avp高效液相色谱仪，SPD-10A vp紫外-可见波长检测器，日本岛津公司；JS-3030色谱工作站，大连江申公司；Kromasil ODS柱，4.6mm×250mm，5μm(大连江申公司)；流动相：甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液pH7.6-三乙胺(15；25；65：0.1，用磷酸调至pH 7.8)；流速：0.8 ml/min；检测波长：220nm，0.10AUFS；供试品溶液的制备：取苦参粉末1.0g，精密称定，置100ml量瓶中，精密加氯仿5Oml、浓氨试液1ml，密塞，称定重量，时时振摇，放置24h后，超声30min，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1Oml，加在中性氧化铝柱(1cm×9cm，内装2cm中性氧化铝)上，收集过柱氯仿液(流速1.0ml/min )，再用2Oml氯仿-甲醇(7：3)洗脱(流速1.0ml/min)，合并洗脱液与过柱氯仿液，置6O℃水浴蒸干残渣用甲醇溶解并定容至5ml，即得。在甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液系统中，流动相的pH对样品色谱分离的影响较大，实验表明，pH越高，样品分离越好，苦参碱的峰形越好，考虑到色谱柱对pH的耐受性，选择pH为7.8。中药网www.zhong-yao.net
张蕾等用离子对反相高效液相色谱法(PIC)测定苦参中氧化苦参碱的含量：日本岛津LC-10AD液相色谱仪；日本岛津SPD-10A紫外检测器；日本岛津CKChrom TM色谱工作站；色谱柱：Hypersil ODS2(大连依利特，200mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-乙腈-水磷酸(10：30：65：0.05，含33mmol／LSDS)；波长：210nm；柱温：室温；供试品溶液的制备：取苦参粉末0.2g，精密称定，置于离心管中，精密加入100倍量(20m1)2％醋酸溶液，室温下静置过夜。以4000r／min的转速离心15min，精密量取上清液2.0ml置10ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。氧化苦参碱和苦参碱测定方法常采用ODS，等，考虑到ODS柱的普遍性和通用性，作者采用离子对色谱法进行测定，本法灵敏、准确、可靠，值得推广应用。
苦参制剂的含量测定：文献报道较多，现对常用的条件分别举一例说明。
单独测定苦参碱的含量：①粱艺英等测定苦参碱葡萄糖注射液中苦参碱的含量。采用Prodigy ODS(3)色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相:甲醇-水-三乙胺(500：500：2)，用0.5mol/L 磷酸瘩液调pH至7.4～7.5;检测波长为220nm。样品溶液制备：分别精密吸取(500mL：150mg)的样品溶液10mL，和(250mL：150mg)的样品溶液5mL，各置25mL量瓶中，分别加入10mL甲醇，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得浓度均为0.12mg/mL 的供试品溶液。②乐云峰等测定苦参碱氯化钠注射液中苦参碱的含量。岛津LC-AOAT泵，岛津SPD-10A紫外检测器，江申色谱工作站；流动相：以0.067mol／L磷酸二氢钾(pH=2.0)-乙腈(60：40)作溶剂的0.04mo]／L十二烷基硫酸钠溶液；色谱柱：Kromasil C18柱(150 mm×4.6mm，5μm)；柱温：(28±2)℃；检测波长：207nm；流速：1.0mL／min；样品用流动相溶解直接进样。也有用磷酸二氢钠缓冲盐的。③单独测定氧化苦参碱的含量：①邢秀芳等测定苦参片中氧化苦参碱的含量。Agilent 1100高效液相色谱仪；工作站为大连依利特公司Echrom98；Inertsil-NH2色谱柱，4.6mmid×150mm，5μm；流动相乙腈-磷酸水溶液(PH2.0)-无水乙醇(8O：10：12)；流速lml／min；检测波长215nm；供试品溶液的制备：取本品1O片，除去包衣，研细，精密称定约1.Og，加盐酸液(0.2mol／L)5ml使溶解，用滤纸滤人分液漏斗中，容器和滤纸用水10m1分数次洗涤，加氢氧化钠液(1mol／L)5ml，摇匀，用氯仿振摇提取5次(25、20、1O、10、10m1)合并氯仿液，定容于lOOml容量瓶中，精密吸取10ml于蒸发皿中挥尽溶剂，残渣用流动相转溶于5ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，此作为供试品溶液。②刘炳茹等测定苦参素软胶囊中氧化苦参碱的含量时，采用C18色谱柱，流动相为0.05mol／L磷酸二氢钠溶液-乙睛-甲醇-高氯酸钠(940ml：50ml：1Oml：20g)，柱箱温度40℃士1℃，流速：lml／min，检测波长220nm。
同时测定苦参碱和氧化苦参碱的含量：①孟根达来等测定人血浆中苦参碱和氧化苦参碱的含量。日本岛津LC-10A型高效液相色谱仪；色谱柱为Et产迪玛Inertsil-ODS一3柱(150 mm×4.6mm，5μm)，柱温35℃；流动相为20％乙腈-磷酸=三乙胺缓冲液(50mmol/L 的磷酸，70mmol/L 的三乙胺，3.7mmol/LSDS，用三乙胺调pH至3.0)；流速1.0mL/min；紫外检测波长为220nm。②杨文远等测定山豆根中苦参碱和氧化苦参碱的含量。高效液相色谱LC-6A 统，SPD-6AV紫外检测器，SPD-M6A 光电二级管阵列检测器（日本岛津）；Shim-pack CLC-ODS(150mm×60 mm，5μm)色谱柱，带有前置保护性；流动相为甲醇-水-三乙胺(55：45：0.02)；紫外检测波长215nm；流速0.8mL／min；柱温50℃。样品处理同2005版药典。③庞树和等测定心律宁片中苦参碱和氧化苦参碱的含量时，采用氨基柱，流动相为乙腈-乙醇-水(80：10：10)，用磷酸调pH=2.0，检测波长220nm。
二、薄层扫描法中药网www.zhong-yao.net
2000版《中国药典》采用此法测定苦参药材的含量。现对常用的实验条件总结如下：
①CS-9000型双波长薄层扫描仪；硅胶G板；展开剂：苯-丙酮-醋酸乙酯-浓氨试液(2：3：4：0.2)；显色剂：碘化铋钾试液+5％亚硝酸钠试液；λS=480nm，λR=650nm，线性参数SX=7，△Y=0.1mm。
②日本岛津CS-930薄层扫描仪；硅腔G薄层板；展开剂：环己烷-醋酸乙酯-二乙胺(8：9：0.6)；显色剂：碘化铋钾试液和5%亚硝酸钠溶液λS=500nm，λR=650nm。
③CS-930型双波长薄层扫描仪(日本岛津)；硅胶G板；展开剂：（环几烷）-氯仿-甲醇-浓氨水(50：6：2)；显色剂：稀碘化铋钾试液；λS=490nm，λR=600nm。
④CS-930型双波长薄层扫描仪(岛津)；硅胶G预制薄层板；展开剂：甲苯-丙酮-乙醇-浓氨水(10：10：1：0.1)；显色剂：稀碘化铋钾溶液。
药材的提取一般用氯仿-浓氨试液浸渍提取；制剂的样品处理方法一般也用氯仿-浓氨试液为提取溶剂，或直接提取，或用乙醇、甲醇等提取后再萃取。
三、毛细管电泳法
罗明等采用高效毛细管电泳法测定苦参碱和氧化苦参碱的含量。P／ACE5OOO型毛细管电泳仪(美国Beckman公司)；石英毛细管57cm×50μm(美国Beckman公司)，有效长度50cm；20mmoL／L 的磷酸盐缓冲液(pH8.0)为电解质，电压为3OkV(运行电流为1OO～110A)，检测波长为214nm，内标物：氨茶碱。信噪比大于2时，苦参碱和氧化苦参碱的最低检测限分别是1.0和0.5μg／mL。实验发现：乙醇法提取的氧化苦参碱含量较高，而酸水渗漉法提取的苦参碱含量较高。
饶毅等应用毛细管电泳法测定了复方苦参注射液中苦参碱、氧化苦参碱的含量。P／ACE5500毛细管电泳仪(美国，Beckman公司)。毛细管电泳条件为：未涂层石英毛细管(57cm×50μm i．d．)，分离电压为12.5 kV，0.2mol／[ Tris-40mmol／L磷酸二氢钠(pH 5.50)-20%异丙醇为缓冲液，检测波长200nm，氢溴酸东莨菪碱为内标。中药网www.zhong-yao.net
另外还有用气相色谱法、离子交换法、分光光度法等测定苦参碱和氧化苦参碱的含量，这里就不作具体介绍了。 |
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