单位：李泽惠（昆明医学院附属第二医院泌尿外科昆明，650101）；许绍斌 褚嘉祐（中国医学科学院医学生物研究所遗传室）；郭萍 章宗籍（昆明医学院病理教研室）；石勇刚（昆明医学院附属第一医院泌尿外科）

关键词：膀胱肿瘤；基因；P16；聚合酶链反应；基因缺失

　　摘要　目的：探讨膀胱癌的发生与P16基因缺失的关系。方法：采用双重PCR法对31例膀胱癌组织中P16基因进行检测。结果：31例膀胱癌组织中有7例存在P16基因缺失，缺失率为22.6%。结论：P16基因缺失与某些膀胱癌的发生存在一定的联系。

The deletions of P16 gene detected in bladder cancer by duplex PCR

LI Ze-hui

　　(Department of Urology,the Second Affiliated Hospital to Kunming Medical College,Kunming,650101)

　　XU Shao-bin　ZHU Jia-you

　　(Division of Gecomics,Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences)

　　GUO Ping　ZHANG Zhong-ji

　　(Department of Pathology,Kunming Medical College)

　　SHI Yong-gang

　　(Department of Urology,the First Afilliated Hospital,Kunming Medical College)

　　Abstract　Purpose:To investigate the deletion of P16 g ene in the bladder cancer.Methods:The P16 gene was analysi s by duplex PCR in 31 bladder cancer tissue samples.Results:The gene deletions were found in seven samples.The deletion ratio of P16 gene was 22.6 per cent.Five cases had deletion in exon 2. One case had deletion in exon 1 and one had deletion in both exon 1 and exon 2.Conclusions:The results suggest that the deletion of P16 gene were associated with some bladder cancer.

　　Key words　Bladder tumor　Gene,P16　Polymeruse chain reaction　Gene deletion

　　1993年，Serrano等〔1〕在研究与CDK4作用的蛋白时发现了P16基因，并克隆了P16的cDNA。随后，许多学者在不同的肿瘤细胞中相继发现了P16基因的缺失或突变。这些结果提示P16基因的失活与肿瘤的发生有关。膀胱癌中P16基因的存在情况国内外报道很少。为了探讨膀胱癌的发生与P16基因缺失的关系，本研究采用双重PCR法对31例膀胱癌病理组织中P16基因进行了检测，现将结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本制备

　　选取我院手术切除的膀胱癌新鲜标本31例，每例标本一部分立即冷冻保存，一部分作常规石蜡切片。另取5例远离癌肿的正常膀胱粘膜组织作正常对照。石蜡标本均制成厚约5 μm的连续组织切片，进行H-E染色和病理组织学检查，病理检查诊断为膀胱移行细胞癌。按Ash病理分级〔2〕和UICC临床分期〔3〕对肿瘤细胞分化程度和浸润范围进行评估。

　　1.2　DNA制备及定量

　　参照文献〔4〕的方法制备DNA，用紫外分光光度计进行DNA定量。

　　1.3　双重PCR扩增

　　根据GenBank所给P16的核苷酸序列，设计两对引物，分别对P16的外显子1和2进行全部扩增。外显子1的引物顺序为：有意义链5′-GAAG-GAGGAGGGGCTGGCT-3′，无意义链5′-GCCTT-

　　CGTCCTCCAGAGTC-3′，扩增长度为316 bp；外显

　　子2的引物顺序为：有意义链5′-TGGCTCTGAC-

　　CATTCTGT-3′〔5〕，无意义链5′-CTGAGCTTTG-

　　GAAGCTCTC-3′〔6〕，扩增长度为388 bp。将H-ras基因作为内对照，引物顺序为：有意义链5′-GGCAGGAGACCCTGTAGGAG-3′〔7〕，无意义链5′-CGCCAGGCTCACCTCTATAGT-3′〔8〕，扩增长度为172 bp。引物均由上海Sangon合成，经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。扩增体系为25 μl，dNTP(100 mmol/L)1 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl,10×buffer(Mg2加free)2.5 μl，Taq酶1 μl(1×106 u/L)(以上试剂均购自上海Sangon)，四种引物各1 μl(25 μmol/L)，DNA模板50～100 ng，矿物油16 μl。在DNA扩增仪(PTC-100 TM，MJ Research Inc)上进行反应。循环条件为95℃反应30 s，60℃反应1 min，72℃反应50 s。循环30次，再72℃反应10 min。

　　1.4　PCR扩增产物电泳

　　PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结束后拍照。

　　2　结果

　　31例膀胱癌病理分级和临床分期分别为Ⅰ级4例，Ⅱ级17例，Ⅲ级7例，Ⅳ级3例；Ta期5例，T1期14例，T2期9例，T3～4期3例。

　　31例膀胱癌标本中P16基因外显子1和2共发现7例缺失，缺失率为22.6%，其中Ⅰ级1个，Ⅱ级4个，Ⅲ级2个；Ta期1个，T1期4个，T2期1个，T3期1个。各对引物的扩增大小与设计一致。

　　3　讨论

　　P16基因作为一种抑癌基因已为人们广泛接受。P16基因定位于9P21上，全长8.5 kb，由2个内含子和3个外显子间隔组成。外显子1为126 bp，外显子2为307 bp，外显子3为11 bp，编码相对分子量为15 845。P16基因是CDK4的抑制因子，CDK4与cyclin-D结合之后能使细胞由G1进入到S期，而P16蛋白能与CDK4-cyclin D复合物结合，并使CDK4激活功能丧失，从而使细胞生长停滞；当P16基因发生单位缺失或突变而导致其表达蛋白功能失活，细胞即进入增殖期〔9〕。

　　本研究采用双重PCR法检测P16基因缺失。双重PCR法作为一种检测基因缺失的方法，比Southern印迹法检测基因缺失操作简单，判断结果快速，结果可靠，具有一定推广价值。本文31例膀胱癌标本中发现7例P16基因缺失，缺失率为22.6%。从病理分级看，分化程度高的膀胱肿瘤(Ⅰ、Ⅱ级)缺失比为5∶7，而分化程度低的膀胱肿瘤(Ⅲ、Ⅳ级)缺失比为2∶7；从临床分期看，侵入膀胱粘膜的早期膀胱肿瘤(Ta～T1)缺失比为5∶7，而侵入膀胱壁深肌层或全层的晚期膀胱肿瘤(T2～4)缺失比为2∶7。这些数据提示P16基因缺失与某些膀胱肿瘤的发生有关。本研究所检测的外显子1和2占P16基因编码区碱基的97.8%，外显子2缺失者有5例，外显子1和2共缺失者有1例，外显子1缺失者有1例。由此提示外显子2的缺失在膀胱癌中是一个较频繁发生的“事件”。

　　云南省应用基础研究基金资助课题

　　参考文献

　　［1］Serrano M,Hannon G J,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature,1993,366:704～707

　　［2］顾绥岳主编.实用外科病理学.南京：江苏科学技术出版社，1987.340～341

　　［3］吴阶平主编.泌尿外科.济南：山东科学技术出版社，1993.445～446

　　［4］吴冠芸，方福德主编.基因诊断技术及应用.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1992，179～180

　　［5］Washimi O,Nagatake M,Osada H,et al.In vivo occurrence of P16 (MTS1) and P15 (MTS2) alterations preferentially in non-small cell lung cancers.Cancer Res,1995,55:514～517

　　［6］Nishikawa R,Furnari F B,Lin H,et al.Loss of P16 INK4 expression is frequent in high grade gliomas.Cancer Res,1995,55:1941～1945

　　［7］Reddy E P.Nucleotide sequence analysis of the T24 human bladder carcinoma oncogene.Science,1983,220:1061～1063

　　［8］Minoru T,Masao O M,Masao O H.Analysis of ras gene mutations in human hepatilc malignant tumors by polymerase chain reaction and direct sequencing.Cancer Res,1990,50:1121～1124

　　［9］Jin X,Nguyen D,Zhang W W,et al.Cell cycle arrest and inhibition of tumer cell proliferation by the P16 INK4 gene mediated by an adenovirus vector.Cancer Res,1995,55:3250～3253