ers。1.0 units of Taq DNA Polymerase(MBI)，模板DNA1O0～200ng，总反应体积25μ1。PCR循环参数为：95℃预变性3min；95℃ 45s，58℃ 60s，72℃ 45s，共35个循环；72℃延伸5min。
1．3．3 PCR产物的高效毛细管电泳 在电泳分析前，先将毛细管柱填充1g／L HPMC，再充以含有3.75μmol／L溴乙锭的8g／L HPMC，电泳分离的缓冲溶液为TBE溶液(45mmol／L Tris，45mmol／L boric acid，1 mmol／L EDTA，pH 8.5)。取PCR扩增产物1Oμl加入内标2×0.0001mol／L Sulforhdamine B溶液0.5μl，在-1OkV下电动进样20 s，并在-1OkV下恒压电泳，用543.5nm 波长的激光激发DNA片段与溴乙锭的结合物产生荧光，在590nm波长下检测。电泳温度为20℃。每次电泳后用0.01 mol／L H3PO4溶液冲洗毛细管5min，再进行下一次检测。pUC19DNA／Msp I(HpaⅡ)Marker用作DNA marker，使用时Maker用适量无菌水稀释。电泳图谱和实验数据用C++语言编制的windows软件进行采集和分析处理。
1．3．4 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 将5μl PCR产物与1μl上样buffer混合后上样于30g／L琼脂糖凝胶中(含0.1μg／ml溴化乙锭)。在0.5×TBE电泳缓冲液中，于100V电压下，电泳50min，采用pUC19DNA／Msp I(HpaⅡ)DNA Marker同时电泳，然后用UVI紫外成像分析仪观察结果。
2 结果与讨论
2．1 毛细管电泳条件的优化
2．1．1 毛细管柱长和内径的选择 分别采用不同内径和长度的涂层石英毛细管柱：50cm×50μmi．d．；50 cm × 75μmi．d．；50cm×100μm1．d．；40cmx 100μm i．d．进行试验。实验结果表明，内径为100μm的毛细管对DNA 片段标准物质pUC19DNA／Msp I(Hpa Ⅱ)Marker 中的110(111)／147 bp DNA 片段的分离度可达2.91，而且内径为100μm的毛细管柱检测光程较大，因而较内径为50μm和75μm的毛细管柱的检测灵敏度高。采用上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页 |
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