内径为100μm的毛细管柱，减少其长度至40cm，对110(111)／147bp标准DNA片段的分离度减少至2.13。因此本实验选用50cm×100μm i．d．的毛细管进行电泳分离。
2．1．2 筛分介质的选择 筛分介质的选择是无胶筛分毛细管电泳中遇到的重要问题。在毛细管电泳分离DNA时，以水溶性高分子化合物如纤维素及其衍生物为筛分介质使用较多。本研究采用HPMC-4000作为筛分介质。由于本实验研究的DNA片段大小在118～142bp之间，所以我们试验了不同质量浓度的HPMC-4000溶液对DNAMarkerll0(111)／147bpDNA片段分离效果的影响。研究结果表明，随着纤维素质量浓度的增加，对DNA片段的分离能力越好，当胶质量浓度达到8g／L时，110／147bpDNA片段的分离度最大(R=2.91)。继续增加胶的质量浓度，分离度变化不大，但筛分介质的粘度增大，分析时间延长。故本实验选用HPMC为8g／L。
2．1．3 分离电压的影响 由于毛细管电泳能在高压下进行，而具有很高的分离效能。改变分离电压，电场强度随之改变，从而影响DNA片段的分离。分别在100V／cm、150V／cm、200V／cm、250V／cm和300V／cm场强条件下对DNA Marker的分离进行了考察。如表2显示，不同大小的DNA标准片段的迁移时间均随场强的升高而减小。对于147bp DNA片段，柱效的考察结果显示，在场强为150V／cm～200V／cm 时具有最高理论塔板数2.3×1O0000。当电场强度高于200V／cm时，迁移时间变短，但焦耳热效应也较为显著，从而引起谱带的展宽，在一定程度上降低了柱效，使分离度降低。为了进行快速分离，我们选用在较高的场强200V／cm下进行电泳分析。
在优化的毛细管电泳条件下DNA相对分子质量标准物质pUCl9DNA／Msp I(HpaⅡ)Marker的毛细管电泳图谱。
2．2 双重PCR扩增条件的优化
引物对ZY1-35S，ZY2-EPSPS用于扩增转基因大豆导入的外源基因中35S启动子和抗草甘膦基因，扩增产物的DNA片段为142 bp；引物对ZY1-NOS，ZY2-NOS用于扩增转基因大豆导入的外源基因中的NOS终止子，扩增产物为125 bp。引物对Lectinl，Lectin2针对大豆凝集素基因，其扩增产上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页 |
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