物的DNA片段为118 bp，用作内参照，确证提取的大豆核酸是否适合PCR扩增，排除假阴性。在优化的分离条件下，PCR产物可直接进行毛细管电泳分离。用无菌重蒸水代替DNA模板作为空白对照，双重PCR同时扩增外源基因经毛细管电泳后无任何峰出现，说明PCR反应无外来物质的干扰。而转基因大豆标准物质和进口大豆的双重PCR扩增产物经毛细管电泳后均出现两个峰，电泳峰2为CAMV-35S启动子-EPSPS抗草甘膦基因的PCR产物，电泳峰3为NOS终止子的PCR产物。对转基因大豆的双重PCR扩增产物进行测序分析，具体序列信息详见GenBank AY564226、AY578916。测序结果显示，该扩增产物的序列与原基因序列完全一致，表明本实验引物设计合理，扩增结果可靠。双重PCR扩增非转基因大豆的外源基因经毛细管电泳没有峰出现而引物对Lectin 1，Lectin2的扩增产物电泳后出现一个峰，为大豆的内源基因PCR产物(118 bp)。由此可见，本方法所设计的引物和优化的扩增条件对转基因和非转基因大豆具有很好的特异性，能够可靠地鉴定抗草甘膦转基因大豆。
2．3 迁移时间的重现性
DNA片段迁移时间的重现性是基因分析中的重要指标之一。我们对DAN片段迁移时间的重现性进行了考察，在优化的实验条件下，对所用的DNA相对分子质量marker和PCR产物连续分析6次，并在待测试样中加入Sulforhdamine B荧光试剂作为内标物，采用相对迁移时间以消除进样时间和电压的波动对迁移时间的影响。在优化的实验条
件下，对所用的DNA marker分析具有很好的重现性，相对迁移时间的相对标准偏差0.90～1.5。对进口大豆的双重PCR产物重复测定，其中125bp和142bp DNA片段相对迁移时间分别是0.504和0.526，其相对标准偏差为2.O～3.2 。
2．4 毛细管电泳与琼脂糖凝胶电泳的比较 将阳性抗草甘膦转基因大豆标准、空白对照和进口大豆的双重PCR产物以及阴性非转基因大豆的内源基因PCR产物同时用毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳进行了比较实验，传统的琼脂糖凝胶电泳结果可见，进口大豆和阳性对照的转基因大豆标准均扩增出2个条带，分别为125 bp和142 bp；作为阴性对照的非转基因大豆仅能扩增出内源基因的118 bp条带；用无菌水作模板的空白对照不能扩增出任何条带。比上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页 |
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