iction Fragment Length Polymorphism ,RFLP) 在许多领域都有成功的应用,也常用于构建中药DNA指纹图谱。限制性内切酶能高度专一地识别和切割DNA序列,不同酶识别不同的DNA序列,因此可利用内切酶的酶解产生不同长度的DNA片段,从而揭示DNA序列水平上的多态性。酶解后的分子量大小不同的DNA可通过凝胶电泳来分离,再将已分离的DNA 与放射性核试验素或荧光标记的核酸探针分子杂交,便可获得信息量大、分辨率高的DNA指纹图。
但目前人们已普遍感到RFLP方法技术步骤繁琐,费时费力,应用不便。自80年代中期PCR技术诞生以来,因其操作简便、不需使用同位素、灵敏度高、特异性强等优点,迅速被应用于相关领域。从常规PCR发展而来的应用随意引物扩增的随机扩增多态性DNA 标记(Radon Amplified Polymorphic DNA ,RAPD) 或称任意引物PCR(arbitrarily Primer PCR ,AP2PCR) 解决了未知特异DNA 序列基因组的扩增问题,它采用任意顺序的引物扩增基因组DNA,可以在不知道特异DNA序列的情况下,检测DNA的多态性。RAPD技术目前广泛用于中药DNA指纹图谱的构建,在目前绝数药用动植物DNA序列还未知的情况下,RAPD技术具有广阔的应用前景。PCR技术的诞生使目的基因极易获得,再与RFLP 联用,还产生了PCR-RFLP、RAPD-RFLP 等方法。RAPD技术的一般步骤如下。
2.1 DNA 提取、纯化与检测 总DNA提取常采用Doyle等的CTAB法,或作适当改进。称取0.5～1g的新鲜或干燥叶片或根组织,置小研钵中,加入液氮迅速研磨成粉末,转移到小离心管中,立即加入预热60℃的CTAB提取液(含CTAB、Tris-HCl、EDTA、NaCl、PVP、β-硫基乙醇等),60℃水浴1h或65℃水浴40min,用等体积的氯仿:异戊醇(CI ,24:1) 抽提,离心;取上层水相,加1/10体积的10%CTAB/0.7mol/LNaCl溶液,轻轻混匀,再加入等体积的CI(24 :1)抽提,离心;取上层水相加入2/3体积预冷的乙醇或异丙醇沉淀DNA,离心,取DNA沉淀,用75%左右的乙醇洗涤2～3 次,干燥后溶于TE 溶液(pH8.0) 中,用RNA 酶酶解或用玻璃奶法纯化,得DN上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页 |
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