A 样品。将DNA 样品在018 %琼脂糖凝胶上进行电泳,检测DNA片段的长度并估测DNA的浓度。
2.2 PCR 反应 24μL 的PCR 反应体系包括:5μmol/L的引物,2μL ,2mmol/L dNTPslμL ,10×buffer (含20mmol/L 1Mg-Cl2) 2.5μL ,5u/μL Taq DNA 聚合酶0.2μL ,10ng/μL模板DNA 2μL 和灭菌双蒸水17.3μL 。PCR 反应程序为:94 ℃5min ,37℃1min ,72℃ 2min ,此程序2个循环后接94℃ 1min ,36℃1min ,72℃ 2min ,38 个循环后接72℃ 10min。每个引物均以2μL 灭菌双蒸水作对照。
2.3 PCR 扩增产物的检测 PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)上电泳,电泳结果在透射式紫外灯下观察并照相。
2.4 数据分析 电泳图谱中的每一条带均为一个分子标记,代表在DNA模板上有一个引物结合位点,不同的样本在凝胶上泳动距离相同则表示它们有相同的位点。可用二元数据(1 ,0) 统计来表示带的有无,用RAP Distance 软件进行数据输入,计算样品间的遗传距离,然后用NTSYS-pc 软件进行聚类分析,用UPGMA 法作聚类图。
90 年代Zabean及Vos等发明、发展了高效检测DNA 多态性的新方法,称为扩增片段长度多态性DNA(Ampli-
fied Fragment Length Polymorphism ,AFLP)。该方法用一人工接头(adapter) 与限制酶切的基因组DNA片段连接,制成AFLP模板DNA,合成一系列3′2末端随机改变数个碱基的PCR 引物进行PCR 特异条件的扩增,经电泳分离检测后可得到DNA指纹图谱。一次实验可检测约50～100个扩增产物,与RFLP、RAPD比较,AFLP 法构建的DNA 指纹图谱具有效率高、重复性好、灵敏度高的优点,而且所检测到的大多数扩增片断与基因组的单一位置对应,展示了AFLP 技术特别适合品种鉴定的应用价值和广阔前景。
3 DNA 指纹图谱在中药研究中的应用
DNA 指纹图谱技术是在分子水平上、以药材基因型特征为鉴定指标的一种新技术,它直接分析遗传物质本身,是分析生物的基因型而非表现型,排除了上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页 |
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